Evaluación de la expresión génica de mica, micb, adam10, adam17 y mmp14 en lesiones intraepiteliales cervicales en pacientes residentes en Bogotá

NKG2D es un receptor activador expresado en las células naturales asesinas involucrado en la eliminación de células transformadas y/o infectadas por virus. Dentro de los ligandos descritos para este receptor están MICA y MICB y la familia de las ULBPs (ULBP1-ULBP6). Por otro lado, uno de los mecanismos de evasión por parte de la célula tumoral es el clivaje de éstas proteínas por parte de metaloproteinasas como ADAM10, ADAM17 y MMP14. Por lo anterior en este estudio analizamos la expresión de los ligandos y de las metaloproteinasas mencionadas anteriormente mediante PCR en tiempo real, en diferentes estadios: muestras con resultado de histopatología negativo, muestras con lesiones intraepiteliales de bajo grado y muestras con lesiones intraepiteliales de alto grado y en las líneas celulares HeLa y C-33 A. A pesar de que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas para ninguno de los genes de estudio en los diferentes grupos si se observó una mayor expresión de las metaloproteinasas en la lesión de alto grado y en la línea celular HeLa. Para el caso de los ligandos en mica se observó una expresión baja en todos los grupos y en micb una mayor expresión en la lesión de bajo grado.Abstract. NKG2D is an activating receptor expressed by natural killer cells involved in the elimination of transformed and/or infected cells. Within the ligands described for this receptor are the related MHC class I molecules, MICA and MICB, and the ULBPs family (ULBP1-ULBP6). On the other hand, one of the mechanisms of tumor evasion is the NKG2D ligands shedding by metalloproteinases like ADAM10, ADAM17 y MMP14. Thus, in this study, we analyzed the expression of NKG2D ligands and metalloproteinases by real time PCR in different stages: Negative samples, samples with low grade and high grade lesions and in the cell lines HeLa and C-33 A. Although no statistically significant differences for any of the genes studied in the different groups, a high expression of metalloproteinases expression was observed in high grade lesion samples and in HeLa cell line. Low expression for mica was observed in all groups studied and an incresead micb expression in low grade lesion samples.Maestrí

Una aproximación a salud personalizada: Identificación y validación de variantes genéticas asociadas con respuesta a tamoxifeno en pacientes con cáncer de seno atendidas en el HUSI

El cáncer de seno está conformado por un grupo de enfermedades multigénicas con gran impacto a nivel mundial, además es el cáncer en mujeres con mayor tasa de mortalidad en Colombia. Para su tratamiento, existen diversas alternativas terapéuticas, una de ellas, la hormonoterapia; donde tamoxifeno (TAM) es el medicamento de primera elección. El tamoxifeno es un profármaco, que requiere la acción de diversas enzimas para su biotransformación y es conocido que la variabilidad genética de estas enzimas, condiciona la presencia de diversos fenotipos que inciden en la capacidad de metabolizar tamoxifeno. En este contexto, se propuso establecer y validar las frecuencias alélicas de variantes en Citocromos de la familia P450 (CYP450) en una muestra de 30 pacientes con cáncer ductal infiltrante que acuden al Hospital Universitario San Ignacio (HUSI) para establecer su asociación con respuesta a tratamiento con TAM, desenlace clínico y sobrevida de pacientes con cáncer de seno así como en 21 mujeres que no presentaban cáncer de seno, para la generación de un prototipo de prueba molecular basado en sondas taqman. Se seleccionaron las variantes genéticas mediante revisión de la literatura. Posteriormente se tomó una muestra de sangre total, con el fin identificar los genotipos y metabolitos intermediarios de TAM (4 hidroxi TAM (4HT), endoxifeno, N desmetil TAM (ND TAM)) y TAM. Adicionalmente, las pacientes diligenciaron cuestionarios y se realizó seguimiento clínico a 12 meses, con el fin de evaluar respuesta al tratamiento y sobrevida. Mediante el panel de Farmacogenética General de “QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System” y análisis de asociación, se identificó que los fenotipos de CYP2D6 tienen la mayor correlación con los concentraciones de endoxifeno. Las variantes funcionales con actividad normal en las pacientes fueron: CYP2D6*1, CYP2D6*2A y CYP2D6*35 mostraron frecuencias de 0,393, 0,295 y 0,032 respectivamente, para el caso de las variantes no funcionales se identificaron CYP2D6*3 y CYP2D6*4 con frecuencias de 0,032 y 0,016; finalmente para las variantes con actividad reducida se identificaron CYP2D6*9, CYP2D6*17 y CYP2D6*41 con frecuencias de 0,032, 0,016 y 0,016 respectivamente, siendo la primera vez que se identifica la variante CYP2D6*9 en población colombiana. Por otra parte, en las mujeres sin cáncer de seno se identificaron las variantes funcionales con actividad normal: CYP2D6*1, CYP2D6*2A y CYP2D6*35 con frecuencias 0,18, 0,14 y 0,02 respectivamente. Para el caso de las variantes no funcionales se identificó CYP2D6*4 con frecuencia de 0,06 y finalmente para las variantes con actividad reducida se identificaron CYP2D6*17 y CYP2D6*29 con frecuencias de 0,01 cada uno. Es la primera vez que se identifica la variante CYP2D6*29 en población colombiana. Por otra parte el modelo usado para el análisis no encontró estadísticamente ninguna asociación entre el estado de los polimorfismos seleccionados y las características histopatológicas, así como tampoco se evidencio el fallecimiento de ninguna de las pacientes motivo por el cual no se evalúo sobrevida. Posteriormente, se generó un prototipo de prueba molecular para tamizaje rápido mediante el uso de sondas y primers que permitió comprobar los genotipos para las variantes CYP2D6*4, CYP2D6*9 y CYP2D6*29, este prototipo podría evaluarse para ser usado a futuro como una alternativa para la evaluación previa de pacientes candidatas a consumir tamoxifeno.Abstract: Breast cancer is a group of multigenic diseases with global burden, being the type of cancer with the highest mortality rate in Colombia. Tamoxifen (TAM) is the first choice drug for hormone therapy. Since tamoxifen is a prodrug, it requires the action of several enzymes for biotransformation, and it is known that the genetic variability of these enzymes, conditions the presence of various phenotypes that affect the ability to metabolize tamoxifen. In this context it was proposed to establish and validate the allelic frequencies of variants in Cytochromes of the P450 family (CYP450) in a sample of 30 patients with infiltrating ductal cancer who come to the University Hospital San Ignacio (HUSI) to establish their association with response to treatment with TAM, clinical outcome and survival of patients with breast cancer as well as in 21 women who did not have breast cancer, for, to contrast its association with the response to TAM treatment, clinical outcome and survival of patients with breast cancer to generate a molecular test prototype based on taqman probes. The genetic variants were selected by reviewing the literature. Subsequently a whole blood sample was taken, in order to identify the genotypes and intermediary metabolites of TAM (4 hydroxy TAM (4HT), endoxifen, N desmetil TAM (ND TAM)) and TAM. Additionally, the patients completed questionnaires and a 12-month clinical follow-up was carried out, in order to evaluate response to treatment and survival. Through the General Pharmacogenetics panel of "QuantStudio ™ 12K Flex Real-Time PCR System", it was identified that CYP2D6 phenotypes have the highest correlation with endoxifen concentrations. Functional variants with normal activity were identified; CYP2D6*1, CYP2D6*2A and CYP2D6*35 with frequencies of 0.393, 0.295 and 0.032 respectively. For the non-functional variants, CYP2D6*3 and CYP2D6*4 were identified with frequencies of 0.032 and 0.016. Finally, the variants with reduced activity identified were CYP2D6*9, CYP2D6*17 and CYP2D6*41 with frequencies of 0.032, 0.016 and 0.016 respectively, being the first time that the variant CYP2D6*9 was identified in Colombian population. When assigning genotypes it was established that 17 of the patients were intermediate metabolizers (MI), 10 extensive metabolizers (ME), 2 women as poor metabolizers (MP) and 1 ultra-fast metabolizer (MU). It was established that the concentration of endoxifen correlates with the patient´s metabolizing state of extensive and poor metabolizers. For controls, functional variants with normal activity were identified; CYP2D6*1, CYP2D6*2A and CYP2D6*35 with frequencies 0.18, 0.14 and 0.02 respectively. For non-functional variant, CYP2D6*4 a frequency of 0.06 was identified. Finally, the variants CYP2D6*17 and CYP2D6*29 with reduced activity had frequencies of 0.01 and 0.01 respectively, being the first time that the variant CYP2D6*29 was identified in Colombian population. After the identification of the variants, CYP2D6*4, CYP2D6*9, CYP2D6*17, CYP2D6*29 and CYP2D6*41 were chosen because for their mayor clinical relevance. They produce phenotypes of poor and intermediate metabolism, a test for rapid screening was generated using the probes and primers for variants CYP2D6*4, CYP2D6*9 and CYP2D6* 29, which is proposed as an alternative for the previous evaluation of the candidates to consume tamoxifen. On the other hand, the model used for the analysis did not find statistically any association between the state of the selected polymorphisms and the histopathological characteristics, nor was the death of any of the patients, reason for which no survival was evaluated. Subsequently, a molecular test prototype was generated for rapid screening by using probes and primers that allowed to check the genotypes for the variants CYP2D6 * 4, CYP2D6 * 9 and CYP2D6 * 29, this prototype could be evaluated to be used in the future as an alternative for the previous evaluation of patients candidates to consume tamoxifen.Doctorad

Implementación de una estrategia ​in-silico para la identificación de péptidos candidatos a vacuna terapéutica individualizada en tumor de paciente con PEComa

En el presente trabajo se expone la implementación de una estrategia ​in-silico para la identificación y priorización de péptidos candidatos a vacuna personalizada en tumores de cáncer aplicado a un caso de estudio de una paciente con PEComa que expresa el alelo HLA-A*24:02. Dicha estrategia se compone de 2 grandes etapas. La primera etapa consiste en la identificación de péptidos candidatos a vacuna personalizada a través de análisis de datos genéticos (ADN y ARN) que permiten la identificación y cuantificación de expresión de mutaciones somáticas presentes en el tumor, a partir de las cuales se obtienen todos los posibles péptidos mutantes (de entre 9 y 21 aminoácidos de longitud) que podría expresar el tumor; estos péptidos son filtrados a través de algoritmos que evalúan la afinidad y estabilidad con el haplotipo HLA del paciente para obtener una lista reducida de péptidos candidatos a vacuna personaliza. En la segunda etapa se realizan simulaciones de docking molecular entre los péptidos cortos previamente identificados (de entre 9 y l0 aminoácidos de longitud) y la molécula HLA-A*24:02 con el fin de evaluar y caracterizar la interacción péptido-HLA de tal manera que proporcione información que apoye el proceso de priorización de péptidos a evaluar de manera ​in-vitro​. Para nuestro caso de estudio, se identificaron 12 péptidos candidatos a vacuna personalizada (6 de los cuales son péptidos largos que enmarcan una epítope tanto para moléculas HLA clase I como para clase II), de las cuales se simuló el d ​ ocking molecular de 5 péptidos cortos (tanto la versión mutada como la nativa) con la molécula HLA-A*24:02. Dichas simulaciones permitieron identificar los puentes de hidrógeno entre el péptido y la molécula HLA y realizar una estimación de la energía del complejo, lo cual llevó a priorizar 2 de los 5 péptidos evaluados. Aunque la estrategia permitió identificar y priorizar péptidos candidatos a vacunas personalizadas en un tumor de una paciente con PEComa, queda como perspectiva extender la estrategia del docking molecular a péptidos largos con moléculas HLA clase II y evaluar la estabilidad del complejo péptido-HLA a través de dinámica molecular.In the present work we present the implementation of an ​in-silico strategy for the identification and prioritization of peptide candidates for personalized vaccine in cancer tumors applied to a case study of a patient with PEComa expressing the allele HLA-A*24:02. This strategy consists of two major stages. The first stage consists of the identification of peptide candidates to personalized vaccine through the analysis of genetic data (DNA and RNA) that allow the identification and quantification of expression of somatic mutations present in the tumor, from which all possible mutant peptides (between 9 and 21 amino acids in length) that could express the tumor are obtained; these peptides are filtered through algorithms that evaluate the affinity and stability with the HLA haplotype of the patient to obtain a reduced list of peptide candidates for a personalized vaccine. In the second stage, molecular docking simulations are performed between the previously identified short peptides (between 9 and l0 amino acids in length) and the HLA-A*24:02 molecule in order to evaluate and characterize the HLA-peptide interaction in such a way as to provide information that supports the process of prioritization of peptides to be evaluated ​in-vitro​. For our case study, 12 peptides were identified as candidates for personalized vaccine (6 of which are long peptides that frame an epitope for both HLA class I and class II molecules), of which the molecular docking of 5 short peptides (both the mutated and wildtype versions) were simulated with the HLA-A*24:02 molecule. These simulations allowed to identify the hydrogen bridges between the peptide and the HLA molecule and to estimate the energy of the complex, which led to prioritizing 2 of the 5 peptides evaluated. Although the strategy allowed to identify and prioritize peptide candidates for personalized vaccines in a tumor of a patient with PEComa, it is possible to extend the molecular docking strategy to long peptides with HLA class II molecules and to evaluate the stability of the HLA-peptide complex through molecular dynamics.Línea de Investigación: Diseño de Vacunas Terapéuticas para Cáncer Basadas en PéptidosMaestrí

Análisis de la mutación BRAF V600E en una serie de pacientes con Histiocitosis de Células de Langerhans del Hospital de la Misericordia

La Histiocitosis de células de Langerhans (HCL) es una enfermedad de comportamiento clínico variable y etiopatogenia desconocida. Desde 2010 se ha informado que 38-64% de todos los casos de HCL albergan la mutación activadora BRAFV600E, pero su significado clínico es incierto; por tanto, se buscó caracterizar las variables demográficas y clínicas de una serie de niños con diagnóstico de HCL para hacer una correlación con la presencia de esta mutación. Esto se hizo por medio de Inmunohistoquímica con el Anticuerpo VE1 usando una escala semicuantitativa y Secuenciación de Sanger en pacientes con diagnostico confirmado de HCL. Se analizaron un total de 50 pacientes (edad promedio: 41 meses), 48% con HCL monosistémica (n:24), 12% con HCL multisistémica sin compromiso de órgano de riesgo (n:6) y 40% con HCL con compromiso de órgano de riesgo (n:20). Con el Anticuerpo VE1 se obtuvo positividad para BRAF V600E en 54% de los casos; 34 de las 50 muestras fueron llevadas a análisis molecular por Secuenciación, y se encontró concordancia de 90,3% entre los dos métodos utilizados para evaluar la mutación. Tanto en el estudio de Inmunohistoquímica como en el de secuenciación, se encontró una diferencia estadísticamente significativa de BRAFV600E con la edad de presentación (2años vs 2 años) (p= 0,021 y p=0.011 respectivamente); no hubo correlación estadísticamente significativa con tipo de HCL o con presencia de secuelas, riesgo de recaída o mortalidad. Las muestras con tinción débil por Inmunohistoquímica para BRAFV600E (1+) requieren confirmación por medio de un método molecular.Abstract: Langerhans cell histiocytosis (LCH) is a disease of variable clinical behavior and unknown pathogenesis. Since 2010 it has been reported that 38-64% of all cases of HCL harbor the BRAFV600E activating mutation, but its clinical significance is uncertain; therefore, we sought to characterize the demographic and clinical variables of a series of children diagnosed with HCL to make a correlation with the presence of this mutation. This was done through Immunohistochemistry with the VE1 Antibody using a semiquantitative scale and Sanger Sequencing in patients with a confirmed diagnosis of HCL. A total of 50 patients were analyzed (average age: 41 months), 48% monosystemic LCH (n: 24), 12% multisystemic LCH without risk organ involvement (n: 6) and 40% LCH with risk organ involvement (n: 20). With the VE1 Antibody, positivity was obtained for BRAF V600E in 54% of the cases; 34 of the 50 samples were taken to molecular analysis by sequencing, and 90.3% concordance was found between the two methods used to evaluate the mutation. Both in the Immunohistochemical study and in the sequencing study, a statistically significant difference of BRAFV600E was found with the age of presentation (2 years vs 2 years) (p = 0.021 and p = 0.011 respectively); there was no statistically significant correlation with type of LCH or with the presence of sequelae, risk of relapse or mortality. Samples with weak staining by Immunohistochemistry for BRAFV600E (1+) require confirmation by means of a molecular method.Otr

Virus del papiloma humano y su asociación con el cáncer cervicouterino: una perspectiva mundial

El virus del papiloma humano se encuentra estrechamente asociado con el cáncer cervicouterino, de los más de 100 virus del papiloma humano, 40 son contagiados sexualmente y pueden infectar piel, mucosa oral y genital, siendo los tipos virales más frecuentes en las lesiones premalignas y malignas el 16 y 18. El cáncer cervicouterino es una patología multifactorial. El objetivo fue determinar la asociación del virus del papiloma humano y el cáncer cervicouterino. La metodología aplicada fue revisión de tipo documental, descriptiva. Entre los resultados se evidencio que el continente Africano es el continente donde la asociación cáncer-infección es más marcada. El cáncer cervicouterino a causa del virus del papiloma humano tiene una distribución mundial, sin embargo, de acuerdo con la literatura revisada, ciertas regiones presentan mayor número de casos a diferencia de otras. Las diferentes metodologías utilizadas en el diagnostico varían de acuerdo a las distintas zonas del mundo, a pesar de ello se evidencia que los métodos utilizados en la detección del cáncer cervicouterino a causa del VPH no tienen mucha variación de un continente a otro. Se concluye que el virus del papiloma humano  se evidencio significativamente en gran parte de los casos de cáncer de cuello uterino, lo cual manifiesta una estrecha asociación entre ambos

Resúmenes de Poster

Resúmenes de Poste